Packages utilisées :

• cluster (version 2.0.3)
• seqinr (version 3.1-3)
• ade4 (version 1.7-4)
• datasets (version 3.2.4)
• graphics (version 3.2.4)
• grDevices (version 3.2.4)
• grid (version 3.2.4)
• methods (version 3.2.4)
• stats (version 3.2.4)
• utils (version 3.2.4)
• igraph (version 1.0.1)
• VennDiagram (version 1.6.17)

Pour utiliser le programme, executez simplement le script "launch.sh" situé dans le dossier 'scripts' et suivez les instructions. Vous devrez alors fournir un fichier fasta qui va être utilisé par VLD pour réécrire les séquences et construire une matrice de distances. Ce fichier matrice de distances doit être modifié par vos soins, en plaçant la dernière ligne en première position dans le fichier. Attention à ne pas rajouter de lignes vides dans ce fichier. Il vous sera ensuite demandé le nombre de groupes à former, les méthodes à utiliser ainsi que les fichiers désirés en sortie (fichiers fasta associés aux groupes, clique etc). Certaines étapes sont assez longues, notamment le chargement des données.

Pour parvenir à catégoriser les X protéines en N groupes, nous avons dù passer par différentes étapes :

• Lecture de la matrice de distances (fichier .raw, matrice diagonale inférieure) et stockage des informations dans une matrice de taille X
• Création d'une matrice dite 'de robustesse' (application de PAM sur les X protéines lues, avec un nombre de clusters demandé variant de min à max). Cette matrice carrée de taille X correspond au nombre de fois où les différentes protéines ont été classées dans le même groupe par PAM. Ainsi, la case [i, j] représente ce qu'on va appeler le ' lien de robustesse de i à j '.
• Visualisation de cette matrice de robustesse sous la forme d'une carte thermique.
• Formation des groupes via deux approches : classement hiérarchique et classement non hiérarchique. La première approche permet d'obtenir des groupes contenant forcément les X protéines même si la stabilité des liens qui les unis est relativement fiable (chaque protéine sera raccrochée à un groupe quoi qu'il arrive). La deuxième, quant à elle, ne forme des groupes qu'avec des protéines qui se sont toujours retrouvées ensemble. On a alors potentiellement des protéines exclues qui n'ont pas toujours été liées à d'autres (on les appellera singletons) mais également la certitude que les groupes retournés ont une stabilité forte.
• Visualisation des groupes sous forme de cliques (dont chaque arc lie 2 protéines par une valeur 'robustesse' variable).
• Écriture / stockage des résultats dans des fichiers texte et fasta pour pouvoir comparer les groupes formés.

• Lecture fichier .raw
• Création matrice de robustesse
• Formation des groupes : classement hiérarchique
• Formation des groupes : classement non hiérarchique
• Visualisation graphique des groupes sous forme de cliques
• Écriture/stockage des résultats dans des fichiers
• Script de lancement de l'application
• Comparaison des approches (hiérarchique et non hiérarchique)
• Amélioration des temps de calcul

1. Lecture du fichier raw : Le fichier d'entrée étant une matrice diagonale inférieure (problème de lecture au début, la dernière protéine (taille n) a été placée en première position dans le .raw)

   • extraction des noms des protéines en première colonne
   • chaque ligne contient de 1 à n 'mots' mais chaque protéine partage une valeur avec les n-1 autres

2. Création de la matrice de robustesse :

   PAM (Partitional Around Medoids) est un algorithme permettant, à partir d'une matrice de distances de taille X et d'un paramètre k, de répartir les X élements de la matrice en k-groupes distincts. L'idée a alors été d'appliquer PAM à notre jeu de données en faisant varier k et ainsi d'observer si certaines protéines se retrouvaient systématiquement dans le même groupe. Si tel est le cas, on peut en déduire que les deux protéines en question ont une forme forte.

   • On différenciera la 'matrice de robustesse globale' des 'matrices de robustesse locales'
     • on a appliqué X fois l'algorithme PAM sur chaque k fixé pour éviter les erreurs dues à l'aléatoire. On a obtenu une 'matrice de robustesse locale' pour chaque k testé.
     • la matrice de robustesse globale 'matG' somme les matrices de robustesse locales 'matL'. On obtient donc pour chaque case [i,j] de 'matG' le nombre de fois que les protéines i et j ont été classées ensemble par les k-applications de PAM.

3. Visualisation graphique

   Pour pouvoir simplement observer les différents groupes révélés par les itérations de PAM, deux fichiers ont été créés : l'un contenant les sommets (les protéines présentes dans la matrice de robustesse) et l'autre contenant les arcs (lien de valeur 'robustesse' (variable) entre deux protéines A et B). On crée ensuite un graphe à partir de ces deux fichiers auquel on ajoute deux paramètres rendant les protéines affichées plus parlantes : la couleur pour son milieu (T, M, P ou H) ou son type (TOP ou RG) (selon le graphique) et la taille pour son règne (A, B ou E).

   Dans le but de tester la stabilité des groupes formés (que ce soit par PAM, hclust et cutree ou par la recherche de réseaux d'amis), plusieurs méthodes ont été testées. On s'intéresse ici uniquement à la méthode avec le cutree et on appellera 'coupe' l'ensemble des groupes trouvés qui découlent de cette méthode. Les coupes auxquelles on s'intéresse sont créées par la méthode "ward.D2" demandée en paramètre par hclust.

   Le paramètre que l'on va faire varier est la matrice de données. On va alors comparer les groupes obtenus directement grâce à la matrice de distance (obtenue après calculs par la méthode VLD), ceux obtenus avec la matrice de robustesse (obtenue après k-itérations de PAM) et ceux obtenus avec une sous-matrice de robustesse à laquelle on lui a retiré un certain pourcentage d'individus (10% ici).

   Pour tester les groupes, on a alors : - une matrice de distances (original) - une matrice de robustesse (application de PAM X fois) - une sous-matrice de robustesse (extraction de 10% des individus de matRob)

   Ces 3 types de coupes sont regroupées au sein d'un même diagramme de Venn pour pouvoir être comparées.

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4. Recherche des réseaux d'amis

   "Les amis de mes amis sont mes amis"

   On utilisera le mot 'ami' pour désigner qu'il existe un lien de robustesse fort entre deux protéines A et B (i.e. matG[A,B] >= 'robustesse'). Deux protéines amies se retrouvent systématiquement dans le même groupe lorsque l'on applique PAM avec n'importe quel paramètre k. On appelera réseau d'amies de X, avec X une protéine quelconque, l'ensemble des protéines qui sont amies avec X ou une amie de X.

   Algorithme (fonction recursive) :

   • récupération de la liste des amies de X et ajout à une liste totale d'amies de X
   • pour chaque amie Y de cette liste, ajout de sa liste d'amies à la liste totale d'amies de X
   • réitération jusqu'à ne plus avoir de nouvelle amie à ajouter aux amies de X
   • on applique cet algorithme à toutes les protéines, on obtient alors une liste d'amies pour chacune d'elles
   • on retire les doublons

5. Écriture/stockage des résultats dans les fichiers

   L'organisation de mon espace de travail s'est faite de cette manière : un dossier par type de fichier traité. Les répertoires 'scripts' et 'fonctions' contiennent les algorithmes utilisés ainsi que les fonctions appelées par ces derniers. Le répertoire 'data' contient les données : fichiers .raw contenant les matrices de distance ainsi que les fichiers sommets et arcs créés pour tracer les graphiques. Enfin, le répertoire 'resultats' contient tous les fichiers graphiques (heatmaps, cliques, diagrammes de Venn), les fichiers liés au temps de calcul et les matrices de robustesse locales qui ont été préservées.

   • gérer les noms de fichiers en fonction de ceux déjà présents dans le répertoire
   • parser les identifiants des protéines pour en extraire les caractéristiques (nom, règne, type et milieu)